热点推荐！6+乳腺癌m6A甲基化修饰模式及肿瘤免疫微环境分析

爱吃不胖的文邹邹

题目：Analysis of m6A Methylation Modification Patterns and Tumor Immune Microenvironment in BreastCancer
发表期刊：Front Cell Dev Biol          IF=6.081


在这项研究中，m6A修饰模式与乳腺癌（BC）免疫景观密切相关，这种经过充分验证的m6A修饰模式评分模型将为描述肿瘤免疫状态和指导有效的肿瘤免疫治疗以对抗BC提供有价值的工具。
乳腺癌中m6A调节因子的遗传变异景观
首先，共鉴定出23个调控RNA甲基化的基因，包括8个writers（METTL14、METTL3、RBM15/RBM15B、CBLL1、WTAP、ZC3H13和VIRMA）、2个erasers（ALKBH5和FTO）和13个readers（FMR1、YTHDF1/2/3、HNRNPA2B1、YTHDC1/2、RBMX、HNRNPC、LRPPPRC和IGF2BP1/2/3）。RNA修饰中m6A甲基化的动态过程和机制如图1A所示。接下来，作者整合体细胞突变和CNV来探索BC中23个m6A调节因子的突变率。m6A调节因子的总体突变频率相对较低，983个样本中只有55个导致m6A调节因子突变（图1B）。在23个m6A调节因子中，LRPPRC、YTHDF1、FMR1、WTAP、YTHDC1、YTHDF3和RNPA2B1在BC发生突变，而其他调节因子未发生突变。此外，发现23个m6A调节因子的CNV改变频率在BC中普遍存在，其中大部分与拷贝数扩增有关。然而，WTAP、RBM15、ZC3H13、YTHDC2、YTHDF2和RBM15B的CNV缺失频率较高（图1C）。染色体上m6A调节剂的CNV改变位置如图1D所示。基于这23个m6A甲基化相关调节因子的表达水平，BC样本可以明显区别于正常样本（图1E）。然后，作者研究了BC和正常组织中m6A调节因子的mRNA表达水平，以确定异常表达是否与BC恶性肿瘤相关。与正常乳腺组织相比，23个m6A调节剂中有17个存在差异表达（图1C，F）。这些结果表明，m6A调节因子的mRNA表达水平在BC和正常组织中具有高度异质性，证明了m6A调节因子异常表达模式在BC的发生和进展中的潜在作用。



图1 BC中m6A调节因子的分子特征和表达变异景观


由23种调节剂介导的m6A甲基化修饰模式
接下来，探讨了m6A调节剂在BC患者中的临床意义，描述了m6A调节剂之间的相互作用及其对BC预后的影响（图2A）。这一结果表明，一些m6A调节因子（如YTHDF1和FTO）与预后不良有关。然而，其他调节因素（如HNRNPC和IGFBR3）与BC患者的良好预后相关。此外，同一功能类别的m6A调节因子的表达也呈现出显着的相关性。然后，作者根据23个m6A调节剂的表达水平对具有不同m6A修饰模式的患者进行分类。通过基于模型的聚类分析，确定了三种不同的甲基化修饰模式，包括m6AClusterA中的685例、m6AClusterB中的617例和m6AClusterC中的498例（图2B）。对m6A修饰的三种主要亚型的预后分析表明，m6AclusterB修饰模式具有特别显着的生存优势（图2C）。此外，分析了临床因素与三种不同m6A甲基化模式的基因表达之间的关系，并在图2D中呈现。



图2 m6A甲基化模式及其生物学特征


通过GSVA富集分析，作者随后打算研究这些不同m6A修饰模式中生物过程的富集。m6AclusterA与免疫抑制和其他生物学过程显着相关。m6AclusterB在与完全免疫激活相关的途径中显着富集，包括Toll_like_receptor_signaling_pathway、T_cell_receptor_signaling_pathway、B_cell_receptor_signaling_pathway和Cheokine_signaling_pathway。此外，m6AclusterC在致癌激活和基质通路中显示出显着富集，例如TGF_beta_signaling_pathway、Adherens_junction和ECM_receptor_interaction（图3A、B）。PCA用于分析三种m6A修饰模式的转录组谱，显示不同修饰模式的转录组谱存在显着差异（图3C）。在随后的TME细胞浸润分析中，发现m6AclusterC在先天免疫细胞浸润中富集，如巨噬细胞、髓源性抑制细胞、自然杀伤细胞、单核细胞、调节性T细胞、CD8T细胞、和DC（图3D）。然而，根据生存生信分析结果，m6AclusterC的患者并不具备相应的生存优势。



图3 GSVA富集分析


m6A甲基化修饰模式的功能注释
为了探索不同m6A修饰模式中潜在的生物调控途径，作者成功鉴定了3429个与m6A表型相关的DEG（差异表达基因）（图4A）。clusterProfiler软件包用于分析DEG的基因本体论（GO）和京都基因和基因组百科全书（KEGG）的功能富集。结果如图4B-E所示。KEGG生信分析表明，DEG在细胞周期、EGFR酪氨酸激酶抑制剂抗性和mTOR信号通路中富集（图4B，C）。对生物过程的GO生信分析表明，这些DEG富含DNA复制、DNA代谢调节和组蛋白修饰（图4D，E）。此外，细胞成分分析表明，DEG在组蛋白甲基转移酶复合物和转移酶复合物以及转移含磷基团中含量丰富。分子功能分析表明，DEGs主要位于解旋酶活性和转录共激活因子活性（图4D，E）。



图4 m6A甲基化修饰模式的功能注释

m6A基因特征和功能注释的构建
为了进一步了解这种调节机制，作者使用来自TCGA和GEO转录组谱的Rlimma包，通过对与m6A表型相关的3429个基因的无监督聚类分析将患者分为不同的基因型。通过基于模型的聚类分析，作者最终确定了三种不同的甲基化修饰模式，包括基因簇A中的685例、基因簇B中的617例和基因簇C中的498例（图5A）。结果与m6A修饰模式的簇分组一致，揭示了三种不同的m6A修饰基因组表型，称为m6A基因簇A、簇B和簇C（图5B）。这表明这三种不同的m6A甲基化模式确实存在于BC中。三个m6A基因簇中m6A调节因子的表达存在显着差异，这与先前m6A甲基化修饰模式的预期结果一致（图5C）。此外，基因簇B的预后良好，而基因簇C的预后不良（图5D）。然而，以上只能基于对患者人群的分析，并不能准确预测个体患者中m6A的甲基化模式。



图5m6A基因特征和功能注释的构建


由于m6A甲基化修饰的个体差异和复杂性，作者构建了一组可以量化个体BC的m6A修饰模型，即m6Acore。图6C显示了个体患者属性的变化。作者使用survminer软件包计算出最佳截断值7.795803，并根据m6Acore成功将患者分为高组和低组（图6A）。这些结果表明，m6A组得分高的患者具有显着的生存获益。然后，分析了m6Acore与生物过程之间的相关性，以阐明m6A的遗传特征（图6B）。此外，Kruskal-Wallis生信分析显示m6A基因簇之间的m6Ascore存在显着差异（图6D）。基因簇C的中位数得分最低，而基因簇B的中位数得分最高，表明m6Ascore低组可能与免疫激活相关特征密切相关，而m6Ascore高组可能与基质激活相关特征相关（图6D）。m6AclusterB的得分高于m6AclusterA和C，m6AclusterC的m6Acore最低（图6E）。



图6 m6A修饰模型


肿瘤体细胞突变中m6A修饰的特征
然后，作者使用maftools软件包分析了TCGA数据库中BC患者高低m6Acore的体细胞突变分布（图7A，B）。结果表明，与低m6Acore队列相比，高m6Ascore队列中PIK3CA的突变率相对较高。随后，肿瘤突变负荷(TMB)的定量分析证实m6Ascore与TMB显着负相关(图7C)。m6Acore较低的患者与较高的TMB显着相关（图7D）。同时，m6Ascore分析显示，低M6Score组的患者死亡比例更高（图7E），并且存活患者的平均m6Ascore高于死亡患者（图7F）。患者的生存分析表明，TMB低的患者比TMB高的患者具有更显着的预后优势（图7G）。为了预测来自TCGA的BC样本的分子亚型，作者探索了低m6Ascore组和高m6Ascore组中basal、her2、luminalA、luminalB和正常患者的比例。结果发现，在高m6Ascore组中，luminalA型占很大比例，而在低m6Ascore组中，基底型占很大比例。然后，根据作者建立的评分，基础亚型在这些亚型中显着表现出最低的m6Ascore，与BC患者的总体预后一致。



图7 高危患者肿瘤体细胞突变瀑布图


m6A修饰模式在抗PD-1/L1免疫治疗中的作用
临床上，PD-L1免疫治疗单独考虑免疫细胞的PD-L1表达，引入免疫细胞比例评分（IPS）作为区分受益者的指标。此外，作者还探讨了IPS与BC中的m6Acore之间的关联。高m6Ascore组的IPS-PD1、IPS-CTLA4和IPS-PD1/CTLA4评分显着增加（图8A-D）。针对PD-1和CTLA-4免疫检查点的抗体的治疗益处可能在高m6Ascore组和低m6Acore组之间有所不同。有证据表明，具有高TMB状态的患者对PD-1/PD-L1免疫疗法具有相对持久的临床反应，上述分析证明m6A修饰模式与TMB和PD-1/PD-L1免疫治疗密切相关。



图8 m6A在抗PD-1/L1免疫治疗中的作用

总结
综上所述，构建的m6A修饰模型可以综合评价个体m6A甲基化模式及相应的TME细胞浸润特征，判断肿瘤免疫表型。此外，作者还证实了m6Ascore与临床病理学特征之间的关系，这甚至可能有助于评估抗PD-1/PD-L1免疫疗法的临床疗效。m6A调节因子或与m6A表型相关的基因的说明将为BC治疗中的个性化评估提供新的策略。