紧跟2023年国自然热点，7+SCI教你如何玩转线粒体自噬

乡下户口

欢迎来小薇的日更公号科研显微镜，如果亲比较缺乏SCI写作经验，自己修改起来费时费力，效果还不一定好，时间久了创新性下降，可以请小薇进行评估，或修改润色哦。
<hr/>在小薇之前分享的国自然热点排名中（插入“近5年国自然热点汇总及2023年热点预测，收藏不亏！”的链接），线粒体及自噬可是在前三名中霸占了两个席位的顶流了，可见线粒体+自噬的王炸组合必定是今年国自然的大热门！


作为一个紧跟热点的专业博主，小薇今天就给大家分享一篇研究线粒体自噬的7+SCI，让我们一起学习下这个经典的研究套路吧！


（时间紧迫的小伙伴直接下拉到最后，get线粒体自噬的研究方法总结！）
1、网络药理学筛选姜黄素和骨关节炎（OA）的共同靶点
该研究首先使用网络药理学方法，从PharmMapper数据库中筛选了90个姜黄素的靶点，再通过DisGENET数据库筛选了1828个OA相关靶点。取交集获得40个共同靶点后，再利用Cytoscape筛选出了7个hub基因。这7个hub基因主要参与了类固醇激素的生物合成、异种生物的代谢、TGF-β信号、破骨细胞分化和癌症通路。而40个共同靶点则涉及刺激反应、代谢过程和多细胞有机体过程等生物功能。


2、动物实验表明姜黄素可减轻大鼠OA的病理特征
随后，该研究构建了OA的大鼠模型，并设置了5个分组，分别为：对照组，OA组，OA+姜黄素组（OAC），OA+姜黄素组+化合物C组（OACC），OA+姜黄素+环孢素A组（OACA）。其中，化合物C是ATP竞争性的AMPK抑制剂，而环孢素A是一种线粒体自噬抑制剂。
结果提示，各组大鼠的体重没有显著差异，可排除体重对OA的影响。H&E和甲苯胺蓝染色结果提示，与对照组相比，OA组的大鼠膝关节组织中出现了软骨基质水肿和空化；而在姜黄素处理的OAC组中，软骨退变有所减轻。此外，股骨和胫骨的Mankin和OARSI评分提示，OA组的组织学评分显著高于对照组，而OAC组与OA组比又有显著的降低。这些结果表明，姜黄素治疗减弱了大鼠膝关节的OA病理特征。


3、姜黄素可激活自噬并减轻软骨退变
该研究还通过免疫组化的方法检测了各组中OA病理学标志物（COLII和MMP13）和线粒体自噬标志物（PINK1、Parkin、P62、Beclin1和LC3B）的蛋白表达水平。结果提示，OA组中被激活的炎症反应，在姜黄素处理下被显著抑制。同时，OA组中发现了线粒体自噬标志物的表达降低，而在OAC组中这些表达异常被显著逆转，说明线粒体自噬在姜黄素的处理下被激活。在OACC组中，由于加入了可抑制AMPK信号的化合物C，导致线粒体自噬被进一步抑制，因此OACC组中这些标志物的表达又与OAC组存在显著差异，并与OA组趋于一致。


4、姜黄素促进软骨细胞增殖
接下来，该研究又开展了一系列细胞实验来探究姜黄素对软骨细胞的影响。首先，该研究从SD大鼠中分离出了原代软骨细胞，免疫组化、甲苯胺蓝染色及荧光双染都识别到了软骨细胞及其中的II型胶原蛋白，表明原代软骨细胞分离成功。经过细胞的培养和传代后，该研究开展了CCK8实验，来确定后续实验采用的药物处理浓度。结果提示，10 μM姜黄素对软骨细胞增殖的影响最为显著，而化合物C和环孢素A的浓度对细胞增殖没有影响。


5、姜黄素挽救了IL-1β诱导的软骨细胞的线粒体功能
对于传代的软骨细胞，该研究采用IL-1β诱导来构建OA细胞模型。随后，通过膜电位、活性氧、Ca2+浓度和ATP水平的检测来评估细胞中的线粒体功能。结果提示，使用IL-1β诱导后，OA组细胞的膜电位和ATP水平显著降低，而ROS和Ca2+水平显著升高，说明软骨细胞线粒体在OA进展过程中受损并失去功能。但这一趋势在OAC组中被逆转。在经过化合物C和环孢素A的处理后，线粒体功能又重新出现了损伤。这些结果说明，姜黄素可以挽救IL-1β诱导的软骨细胞中的线粒体功能损伤。


6、姜黄素通过AMPK/PINK1/Parkin通路激活线粒体自噬以减弱OA进程
最后，该研究又通过WB和PCR实验检测了细胞中线粒体自噬标志物的表达。结果同样提示，姜黄素可以显著提高II型胶原蛋白及线粒体自噬标志物的表达，同时还可以抑制OA炎症标志物（MMP13和IL-1β）的表达。此外，姜黄素还激活了OA软骨细胞中AMPK的磷酸化水平。但是，当AMPK通路被抑制后，OACC组中这些标志物的表达又被显著逆转。免疫荧光共定位实验结果表明，OAC组线粒体自噬标志物LC3B和COXIV的共定位水平明显高于OA组。透射电镜观察线粒体形态后发现，OA组中存在较多受损的线粒体，而OAC组中受损的线粒体被自噬体吞噬，表明自噬被激活。因此，该研究进一步得出结论，认为姜黄素可以通过AMPK/PINK1/Parkin通路激活线粒体自噬以减缓OA的病理进程。


线粒体自噬研究方法总结：

• 线粒体功能检测：
  

• 线粒体膜电位测定（JC-1进行标记，荧光显微镜+流式细胞仪检测）；
  
• ATP水平测定（酶标仪测量发光强度）；
  
• ROS浓度测定（DCFH-DA标记+流式细胞仪检测）；
  
• 钙离子浓度测定（Fluo-4AM标记，转化为Fluo-4后用流式细胞仪检测）。
  

2. 线粒体形态观察：透射电镜观察线粒体受损情况，以及具有线粒体样细胞器的自噬体。
3. 线粒体自噬标志物检测：PINK1, Parkin, p62, Beclin1, LC3B
4. 抑制线粒体自噬：环孢素A (cyclosporin A)
这篇文章是一篇典型的研究中药治疗疾病的线粒体自噬调控机制的文章，全文逻辑清晰，包含完整的体内体外实验，无论是做方案设计还是标书写作，都是值得参考的文章。当然，要说仅有的一点不足，便是前面的网络药理学部分和后面的实验部分似乎存在一些逻辑上的分割。但这点瑕疵掩盖不了它闪闪发光的优点，大家参考时要学会扬长避短哦~
相信看到这里的小伙伴们一定有所收获，对于线粒体自噬的研究方法也更加了然于心。如果大家想要优化自己的文章逻辑，或者是想把握住这样的热点冲一波国自然，都欢迎大家扫码联系小薇哦！