文献详解丨又双叒叕有人靠肿瘤干性这一热点发了高分生信 ...

大眼明明

撰写：生信小师妹 来源：小张聊科研平台的“ i生信”公众号，微信公众号搜索“ i生信”即可关注/扫描关注见文末
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今天跟大家分享一篇Stem Cell Res Ther期刊发表的肿瘤干性相关高分生信文章，文章题目：Characterization of stem cell landscape and identifcation of stemness-relevant prognostic gene signature to aid immunotherapy in colorectal cancer.


研究背景
人们普遍认为结直肠癌起源于肿瘤干细胞(CSCs)，CSCs与结直肠癌的进展、转移和治疗抵抗有关。CSC的高度异质性阻碍了结直肠癌靶向治疗的临床应用。该研究作者通过全面描述高度异质性的CSC及其与肿瘤微环境的关系，以期预测结直肠癌患者的预后和对免疫疗法的反应。
研究思路
作者首先基于干细胞基因集，对TCGA和GEO数据库中的结直肠癌样本进行肿瘤干性亚型，然后比较不同亚型在预后、肿瘤微环境（TME）、治疗反应等方面的差异。最后，通过WGCNA分析筛选出影响预后的干性相关基因、Cox回归和随机森林分析构建干性风险模型，并进一步探讨其与结直肠癌的预后、TME类型、分子功能和化疗/免疫治疗效果的相关性。


研究结果
（1）基于细胞干性基因集将结直肠癌患者识别为不同的干性亚型
首先用ssGSEA量化每个结直肠癌样本中26个干性基因集的富集得分，然后通过非监督聚类，将结直肠癌患者分为三种干性亚型（C1,C2,C3）。结果发现在三个干性亚型中，C1对大多数干细胞基因组具有广泛的富集程度；C2表现出对预后有利的干性基因集的高度富集；而C3显著富含预后不良的干性基因集。同时，生存分析显示，与其他两组相比，C3组结直肠癌患者的总生存期（OS）最差。为进一步阐明肿瘤微环境（TME）在干性亚型中的情况，作者通过免疫浸润分析比较了三组干性亚型患者间的TME组分以及免疫和基质评分。结果发现C3表现出免疫抑制亚型，其特征是M0巨噬细胞和M2巨噬细胞的高丰度；C2显示较高的抗肿瘤TME成分，如CD8+T细胞、激活的记忆CD4+T细胞等；而C1显示中等程度的TME浸润。


（2）干性亚型间的化疗敏感性和免疫治疗反应
作者通过计算IC50值评估几种化疗药物的化疗敏感性，并在干性亚型间进行比较。结果发现，博素替尼（Bosutinib）、多西他赛（Docetaxel）、伊利司莫（Elesclomol）等多种化疗药物在C3群中的IC50值明显较低，这意味着C3亚型可能对这些药物更敏感。此外，作者又通过TEDE算法评估了这三种亚型的免疫治疗反应。与免疫浸润分析结果一致的是，C2组包括更丰富的CD8 T细胞等杀瘤细胞的浸润，C2组患者中受益于免疫治疗的患者比例显著高于C1组和C3组。然而，免疫抑制的M2巨噬细胞增加，M1巨噬细胞和CD8T细胞减少可能使C3群的免疫治疗应答率最低。


（3）WGCNA分析鉴定C3亚型相关核心基因
由于C3亚型结直肠癌患者从免疫治疗中获益最少，生存最差，作者进一步通过WGCNA分析确定GSE39582数据集中该亚型的典型基因。分析结果中绿松石（turquoise）基因模块与C3亚型正相关最强，与C2亚型负相关最强，因此选择绿松石模块作为目标模块，并从其中筛选出138个基因作为核心基因，进一步通过功能富集分析探究了它们的功能通路。


（4）基于核心基因构建干性风险模型并验证
首先单因素COX回归分析筛选与OS显著相关的基因，然后用随机森林方法提取了由五个基因组成的signature，用于构建干性预后模型。并基于模型计算了每个结直肠癌患者的干性风险评分。值得注意的是，C3的风险评分最高，而C2的风险分评分最低。生存分析显示，与干性风险评分低的患者相比，干性风险评分高的患者预后明显较差。


（5）干性风险特征与肿瘤免疫微环境的相关性
为探究干性风险特征与肿瘤免疫微环境的相关性，作者通过CIBERSORT和ESTIMATE获得了结直肠癌样本中22个免疫细胞的比例以及免疫和间质评分。结果发现随着干性风险评分的增加，M2巨噬细胞和M0巨噬细胞的比例以及免疫和间质评分增加，而活化的NK细胞、CD8 T细胞和T细胞滤泡辅助细胞的比例减少。同时发现高风险组患者的幼稚B细胞、M0巨噬细胞、M2巨噬细胞、中性粒细胞、免疫和间质评分更为丰富。而低风险组的几种抗肿瘤免疫细胞（包括CD8T细胞、激活的记忆CD4 T细胞等）更丰富，这表明低干干性风险组表现出抗肿瘤免疫，而高干度风险组免疫抑制细胞较高。综上所述，由于基质和M2巨噬细胞介导的免疫抑制效应，高干性风险组患者对免疫治疗的敏感性可能较低，低风险组患者可能对免疫治疗更敏感。


（6）干性风险评分在化疗敏感性和免疫治疗疗效预测中的价值
上述结果已表明C3亚型对几种化学药物更敏感，但对免疫治疗反应不太敏感。同样的IC50分析方法发现，高干性风险组对多种化疗药物更敏感。TIDE方法预测免疫治疗反应发现，治疗响应患者的干性风险评分显著低于无反应的患者，低风险组免疫治疗有效者的比例是高风险组的2.5倍。此外，为了进一步测试预后模型在免疫治疗效益预测方面的能力，作者通过两个免疫治疗数据集进行验证，结果发现抗PD-L1治疗完全缓解(CR)和部分缓解(PR)的患者干性风险评分显著低于稳定期(SD)和进展性疾病(PD)患者，高干性风险组患者的疗效显著低于低干性风险组，而且高干风险组的生存时间显著短于低干风险组。这些结果表明，干性风险评分低的结直肠癌患者可能对免疫治疗更敏感，且有着较好的预后。


（7）干性风险评分与其他CRC干性模型的比较
已有研究通过应用OCLR算法，根据基因表达谱计算每个患者的mRNAsi，进而量化患者的肿瘤干性。因此，作者进一步探究了mRNAsi和干性亚型之间的相关性。结果发现C3亚群主要集中在低mRNAsi区域，而C2组患者有最高的mRNAsi。同样，mRNAsi在低干性风险组中明显较高，而且mRNAsi与干性风险评分高度负相关。生存分析表明，低mRNAsi的患者比高mRNAsi患者的OS更长。
此外，已有两个研究基于干性指数（mRNAsi）确定了15-mRNA和3-mRNA的mRNAsi相关signature，为了确定本研究干性亚型相关的5-mRNA signature是否优于这些模型，作者通过TIDE分析比较了这三种模型估计免疫治疗反应的预测能力。ROC分析显示，本研究的预测性能最好（AUC值最大）。


（8）实验验证COLEC12基因对结直肠癌细胞干性特征的影响
通过随机森林存活分析，在所有5个基因中，COLEC12被确定为最显著的一个，因此作者通过Western blot分析从功能上验证了COLEC12在促进CSC特性方面的潜在作用。利用特异性siRNAs成功地抑制了Caco-2细胞中COLEC12的表达。随后，利用肿瘤干细胞成球实验评估COLEC12对干性的影响，结果表明，在Caco-2细胞中，COLEC12敲减后，球体的数量和大小明显减少，表明抑制了肿瘤细胞的干性。此外，作者还检测了干细胞标记物的蛋白表达，结果表明，COLEC12敲减后LGR5、CD44、SOX2和NANOG的蛋白水平降低，进一步表明COLEC12影响了结直肠癌细胞的CSC特性。


研究结论
作者通过对干细胞基因集的非监督聚类，首次系统地鉴定了三种不同预后、TME模式和治疗反应的干性相关亚型。并通过WGCNA、COX和随机生存森林分析，构建了一个五基因干性相关风险模型，并在大量的结直肠癌患者中进行了验证。总之基于干性亚型对结直肠癌患者进行前瞻性分层，并结合预后模型的特点可能是指导更有效的患者特异性治疗的新策略。
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