国自然热点文献——可变剪切

浪漫没有后来

Hi，大家好，今天咱们分享的文献主题是可变剪切~
首先我们通过SCI文章数据及中标项目数来了解一下可变剪切的研究情况。
在pubmed数据库中输入“alternative splicing”，可搜索出来的文章数量为37972篇左右。从下图分析得到，可变剪切从1978年就有文章发表，且在近25年，每年发表的与可变剪切相关的SCI文章数量均在1000篇以上，由此可知，可变剪切一直是科研者的关注点。


从国自然立项情况来看，近10年的中标个数及总金额非常可观，具体可见下图（2022年的数据不完全，暂不参考），由此同样说明，可变剪切是科研者们探究的重点关注方向之一。


从以上的数据来看，可变剪切在科学研究领域中的地位不言而喻，那么本月，就让我们一起来了解可变剪切这一知识点吧！先来了解一下可变剪切相关概念及其一些基本知识。


什么是可变剪切？
可变剪切（differential splicing）也叫做选择性剪切（alternative splicing，AS）：指的是在 mRNA 前体到成熟 mRNA 的过程当中，不同的剪切方式使得同一个基因可以产生多个不同的成熟 mRNA，最终产生不同的蛋白质。
可变剪切在真核生物体内广泛存在，有研究指出，对于人类基因组中包含多个exon 的基因而言，其中有 95%的基因都存在可变剪切现象。可变剪切导致了转录本和蛋白质结构与功能的多态性，是一种重要的转录调控机制。
那么，如何来研究可变剪切相关课题呢？让我们通过文献来了解怎么切入这个主题。


本次分享的文献题目是：DAZAP1 facilitates the alternative splicing of KITLG to promote multiple myeloma cell proliferation via ERK signaling pathway，影响因子5.955分，发表在Aging杂志上，发表时间为2022年10月。
先来了解一下本文的研究背景：
多发性骨髓瘤(MM)是第二常见的恶性血液病。目前，复发和耐药是MM患者发病和死亡的主要原因。因此，阐明MM恶性增殖的机制，寻找治疗MM的新策略显得很有必要。真核转录本的选择性剪接(Alternative splicing, AS)是基因表达的重要组成部分，该机制拓宽了功能蛋白的多样性，从有限的基因，最终产生具有不同甚至相反功能的蛋白质。很多研究证据表明AS变化是肿瘤进展和治疗的重要标志。DAZAP1是一种RNA结合蛋白(RBP)，在多种组织中表达，参与转录后修饰，如AS。大量证据表明DAZAP1在多种癌症的调控中起着至关重要的作用。然而，DAZAP1在MM增殖中的作用及其机制尚不清楚。因此，在此项研究中，作者以可变剪切的方向入手，探讨了DAZAP1对MM细胞的增殖作用及其具体调控机制。
接下来直接分享作者所取得的结果：



一、高表达DAZAP1与MM患者生存期差有关
为了评估DAZAP1与MM的相关性，作者首先分析了GEP cohorts数据中DAZAP1表达情况。GSE5900的数据显示，与正常浆细胞相比，MM样本中的DAZAP1显著增加(图1A)。四个独立的GEP cohorts包括GSE2658、GSE9782、GSE19784和GSE136337数据显示，高表达DAZAP1与MM患者生存期差明显相关(图1B-F)。此外，作者还比较了基线样本和复发样本中的DAZAP1表达，结果发现复发MM患者的DAZAP1表达增强(图1G)。同样的，PR亚组是MM中具有高增殖特征的类型，其DAZAP1表达明显高于其他7个亚组(图1H)。以上结果提示DAZAP1表达增加与MM患者预后不良相关。





二、DAZAP1表达升高促进MM细胞体外增殖
为了进一步探讨DAZAP1在MM细胞增殖中的作用，在CAG和OCI-MY5细胞中，作者利用慢病毒转染对DAZAP1进行过表达，同时，利用小干扰RNA对DAZAP1进行了敲除。转染效率用WB进行了验证 (图2A-B以及补充材料)。CCK8检测结果显示，DAZAP1过表达明显促进了MM细胞的增殖能力，DAZAP1敲除明显抑制了MM细胞的增殖能力 (图2C和2D)。此外，软琼脂集落形成实验发现，DAZAP1过表达细胞具有较强的长期增殖能力(图2E和2F)。综上所述，过表达DAZAP1促进了MM的增殖。

三、DAZAP1促进MM小鼠中肿瘤的生长
作者进一步体内检测DAZAP1的作用。首先把CAG EV细胞(小鼠左侧)和CAG DAZAP1过表达细胞(小鼠右侧)皮下注射到NOD/SCID小鼠。如图3A-D所示，CAG DAZAP1过表达细胞形成的肿瘤明显大于CAG EV细胞形成的肿瘤。另外，通过对DAZAP1过表达组和EV组肿瘤组织的差异基因的比较，KEGG途径富集分析显示，MAPK信号通路中有较多的基因被富集，提示该信号通路可能参与了DAZAP1对MM细胞增殖的调控(图4A)。有报道称ERK信号通路（是MAPK信号通路中的主要信号通路）在MM细胞增殖中起重要作用。因此，作者想验证DAZAP1是否通过激活ERK信号通路促进MM增殖。因为RAS可调节ERK的磷酸化。因此，作者首先检测了DAZAP1表达对RAS-GTPase活性影响。结果表明，过表达DAZAP1可显著增加RAS-GTPase活性(图4B和补充材料)。此外，WB试验表明过表达DAZAP1会增加了MM细胞中的ERK磷酸化，而敲除DAZAP1则有效地逆转了结果 (图4C-D和补充材料)。以上结果提示，DAZAP1过表达可能通过激活ERK信号通路促进肿瘤的进展。





四、DAZAP1激活MM细胞中KITLG mRNA的选择性剪接
为了进一步研究DAZAP1在MM中的调控机制，通过rMARTs的AS分析定义了数千个DAZAP1介导的AS事件。图A显示，跳过外显子(SE)是AS事件的主要类型，占AS事件总数的64.6%，其次是alternative 3’splice site (A3SS)和互斥外显子(MXE)，其余类型的AS事件，替代5 '剪接位点(A5SS)和保留内含子(RI)的频率较低，说明DAZAP1主要调控SE。作者进一步确定DAZAP1结合在盒式外显子和3 '剪接位点附近的位置效应通常促进外显子跳跃(图5B)。图5C显示AS的典型结构域。作者将RIP-seq与MM GEP cohorts的分析结合起来，筛选与MM进展相关的DAZAP1调控的AS靶点。根据该策略，选择跳跃第6外显子的KITLG作为下游靶基因去探讨其是否促进 MM进展。KITLG有两个剪接异构体，KITLG isoform2 (NM_000899.5)含有初级蛋白水解裂解位点，KITLG isoform1 (NM_003994.6)缺乏初级蛋白水解裂解位点(5 D)。此外，KITLG的207029_at探针与TT3期MM患者生存率较好相关(图5E)。相反，KITLG的226534_at探针与TT3期MM患者生存率较差相关(图5F)。为了评估可变剪接分析的准确性，作者用PCR方法对MM中KITLG的这两种剪接异构体进行了验证。过表达DAZAP1会导致长转录本的减少 (图5 G)。RIP-qPCR证明DAZAP1直接与内源性KITLG isoform2结合并促进其剪接(图5H)。





五、KITLG的异常剪接有助于ERK的磷酸化
本研究提出了DAZAP1通过影响KITLG AS事件调节ERK信号通路。为了进一步验证这一假设，作者通过电穿孔使KITLG isoform1和KITLG isoform2转染进入HEK293细胞。用1%琼脂糖凝胶电泳和WB检测转染效率，用WB检测ERK磷酸化水平。结果表明，过表达KITLG isoform1促进ERK的磷酸化而KITLG isoform2过表达抑制磷酸化(图6A-C，补充材料)。同样的结论在MM细胞中得到验证(图6B-D和补充材料)。综上所述，KITLG isoform1 促进MM细胞中的ERK磷酸化。



此篇文献的结果分析到这就全部结束了，基本研究思路及文献的主要内容应该了解的差不多了吧~



我们再来简单总结一下作者取得的实验结果：
1、分析MM的临床数据库，发现DAZAP1升高的MM患者生存期较差；
2、发现DAZAP1在体外促进MM细胞增殖，在体内加速MM移植瘤生长；
3、KEGG通路富集分析显示，ERK信号通路在DAZAP1-OE MM细胞中被激活；
4、通过RIP-seq和RIP-qPCR分析得到DAZAP1激活KITLG mRNA的选择性剪接；5、DAZAP1通过调节KITLG mRNA的选择性剪接增加ERK磷酸化，促进MM细胞增殖。





综上所述，DAZAP1在MM肿瘤中起促进作用，DAZAP1可能作为MM肿瘤的诊断标记物以及靶向DAZAP1可能成为MM的治疗方法。


此篇文献分享到这就结束了哦！
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