国自热点——这篇EMT二元变量论证竟有27分！

枫笛

今天分享的是 2019 年 3 月发表在 molecular cancer 的一篇文章，影响因子为 27.401。
首先，我们根据题目和摘要提取科学要素，做出科学假设。


题目：Hypoxic BMSC-derived exosomal miRNAs promote metastasis of lung cancer cells via STAT3-induced EMT
【题目四要素】疾病：肺癌
表型：转移+EMT
主变量：miR-193a-3p, miR-210-3p and miR-5100
效应变量：STAT3
供体细胞：BMSCs
受体细胞：lung cancer Cells(LCCs)
交通工具：外泌体
【科学假设】
在【肺癌】中，【BMSCs】在低氧情况下，可以通过【外泌体】传递【miR-193a-3p, miR-210-3p and miR-5100】，阻断【STAT3 的结合】进而介导【EMT/侵袭/迁移】。
【背景介绍】
肺癌具有高度致死性。既往有报道，外泌体可能参与到肺癌的发生发展。而干细胞，由于多    向分化潜能，从而促进癌症的恶性程度。那么 BMSC 是否能够与肺癌之间存在细胞交互作用，尚未可知。
【图表信息解读】
Part1:细胞交互论证【BMSCs   低氧状态下与肺癌细胞与侵袭/转移的关系（动物层面+细胞层面）】




图 1. 低氧状态下，BMSCs 可以通过分泌外泌体的方式，促进肺癌细胞的侵袭和转移。

• 裸鼠成瘤实验，联合  BMSCs  与肺癌细胞培养组，其成瘤组织明显大于单纯注射肺癌细胞组。
  
• 肺组织转移模型实验，观察到联合  BMSCs  与肺癌细胞培养组，肺组织转移情况明显大于单纯注射肺癌细胞组。
  
• 肺部转移组织 HE 染色，与单纯注射肺癌细胞组相比，发现联合 BMSCs 与肺癌细胞培养组的细胞密度更大。
  
• 检测联合 BMSCs 与肺癌细胞培养组与单纯注射肺癌细胞组，外泌体 microRNAs 的高表达/低表达情况。（动物层面）
  
• 分别进行 BMSCs 的常规及低氧条件下，培养 3 天，收集 BMSCs 分泌的外泌体进行分层聚类分析（Hierarchical clustering analysis），获得高表达/低表达的外泌体 microRNAs
  
• 检测联合 BMSCs 常规培养及低氧条件下，外泌体 microRNAs 的高表达/低表达情况。（细胞层面）
  
• D、F（细胞、动物层面）的韦恩图，获得共同高表达的 248 个外泌体 miRNA。
  
• qPCR 验证韦恩图获得的外泌体 miRNA 表达情况，得到具有升高趋势且含有明显差异的外泌体：miR-193a, miR-210-3p 和 miR-5100。（Tips：作者如何从 248 个外泌体中， 选择 11 个进行检测，这部分在正文及补充图中均未阐述。考虑可能时根据相关性评分， 从上到下排序后进行的选择，但是，图中的检测顺序，是否按照相关性高低进行排序， 并不知晓）
  

补充图 1.分离鉴定外泌体。
小结 1:首先从动物层面进行联合培养外泌体培养, 围绕交互-表型进行相关论证，再到细胞层面的外泌体培养进行佐证，两者取交集，获得共同上调的外泌体 miRNAs。
在逻辑维度上：论证了 BMSCs 与肺癌细胞之间具有交互作用。在数据维度上，涉及到细胞、动物实验。
Part2. 外泌体与表型的单变量论证


图 2. 低氧状态下 BMSCs 分泌的外泌体可以通过 EMT 模式促进肺癌细胞的转移。
AB.Transwell 检测，两株肺癌细胞的侵袭和迁移情况。发现缺氧状态下，外泌体可以导致LLC 细胞的侵袭程度增加。
C.qPCR 检测上皮-间质 marker 表达，发现低氧培养组的 EMT marker 均高于常规培养组。DE.动物实验，肺部转移情况进行验证。


补充图 2. 补充论证低氧状态下 BMSCs 分泌的外泌体可以通过侵袭/迁移模式促进肺癌细胞的转移。
EMT 对侵袭/迁移的调控论证（缺失）
小结 2:涉及到的表型：以 EMT 为主，还有嵌套的细胞侵袭和迁移表型。
在论证形式上：采取多表型多实验论证、多株细胞系平行验证、细胞、动物。


Part3.主变量（外泌体 miRs）的单变量论证
图 3.BMSCs 分泌 miR-193a, miR-210-3p 和 miR-5100。

• Transwell 检测 miR-193a, miR-210-3p 和 miR-5100 的侵袭能力，发现通过过表达三个外泌体，能够获得最高的侵袭能力。（一正）
  
• Transwell 检测 miR-193a, miR-210-3p 和 miR-5100 的侵袭能力，发现通过抑制三个外泌体的表达，侵袭能力最低。（一反）
  
• qPCR 检测上皮-间质 marker。发现，抑制外泌体的分泌后，EMT marker 表达情况均下降。（沉默主变量观察表型）
  

补充 3.对主变量单变量论证的形态学补充。


图 6. 外泌体 miRNA 癌症转移的标志物。

• 临床样本检测。与正常人相比，miR-193a-3p ，miR-210-3p 和 miR-5100 在癌症患者中高表达。
  
• 临床样本检测。与正常人、原位肺癌相比，miR-193a-3p ，miR-210-3p 和 miR-5100 在肺癌转移的患者中高表达。
  
• ROC 曲线分析，与正常人相比，miR-193a-3p ，miR-210-3p 和 miR-5100 在癌症患者中诊断效能大。
  
• ROC 曲线分析，与正常人、原位肺癌相比，miR-193a-3p ，miR-210-3p 和 miR-5100 在肺癌转移的患者中诊断效能大。
  

补充图6.三个外泌体两两组合后，观察 ROC 曲线下面积，无高敏感性和特异性。
小结3:主变量（外泌体）的单变量论证。包括一正一反，与 EMT、迁移表型的调控性论证。本部分单变量论证，验证维度有细胞,有动物，有临床样本。


Part4: 观察外泌体的去路（进入受体细胞内）


图 4.外泌体从供体细胞中来，进入受体细胞。

• 免疫荧光染色，给受体细胞一个 RFP 红色荧光标记，使用 PKH67 检测外泌体表达。发现低氧组，外泌体表达量更多。（证明缺氧状态下受体细胞外泌体分泌增多）
  
• qPCR 检测受体细胞分泌的 miR-193a-3p, miR-210-3p 和 miR-5100 的表达，发现受体细胞内外泌体增加。（证明缺氧导致受体细胞内外泌体分泌增多）
  
• qPCR 检测在外泌体抑制剂的作用下， 受体细胞内 miR-193a-3p, miR-210-3p 和miR-5100 的表达被抑制。（证明阻断供体细胞分泌的外泌体，受体细胞内的外泌体含量降低）
  
• 流式技术分选带有 RFP 标记的受体细胞。发现 RFP 信号随着共培养时间的延长而增加。
  
• qPCR 检测共培养细胞和不含 BMSC 培养的肺癌细胞之间，miR-193a-3p, miR-210-3p 和miR-5100 的表达。发现共培养细胞内，外泌体含量增加。（证明受体细胞本身不产生外泌体， 但是共培养可以让受体细胞获得外泌体）
  

知识点：
GW4869，可以抑制外泌体分泌PKH67（外泌体绿色荧光标记染料） RFP（红色荧光染料）
拓展：【其他外泌体染料】外泌体红色荧光标记染料（PKH26）、外泌体荧光染料（DiR）


补充图 4.供体细胞内外泌体的产生与释放

• 缺氧条件下，受体细胞的外泌体含量高。
  
• BMSC 细胞，在常氧状态下含量高，在缺氧状态下含量低。说明 BMSC 在常氧状态下， 外泌体储存在胞内，当细胞发生缺氧时，胞内外泌体被释放出去。
  

知识点：U6 snRNA 在做 miRNA 实时荧光定量 PCR 中充当内参
小结 4.观察受体细胞摄入外泌体的情况。
（图 1-4）在逻辑维度上论证：
【外泌体从哪儿来】 受体细胞不产生外泌体
供体细胞分泌的细胞微囊泡是外泌体供体细胞在常氧状态下储存外泌体 供体细胞在缺氧状态下释放外泌体
【外泌体到哪儿去】
供体细胞分泌的外泌体可以被受体细胞摄取，共培养后，受体细胞外泌体增多   阻断供体细胞分泌的外泌体后，共培养后，受体细胞内的外泌体含量下降
Part5.受体细胞内机制探索【主变量上游的调控】


图 5.BMSCs 分泌的外泌体，通过效应变量 STAT3，促进受体细胞的 EMT 转化。

• RNA-Seq 检测，发现上调的基因在 JAK-STAT 通路富集。（细胞维度寻找效应变量）
  
• WB 检测 STAT3, p-STAT3 的蛋白表达。
  
• Transwell 检测细胞侵袭。发现抑制 stat3，可以回复外泌体对侵袭的作用。（Rescue）
  
• qPCR 检测 Snail 和 Vimentin 的 mRNA 表达。发现抑制 stat3，可以回复外泌体对 EMT 的作用。（Rescue）
  
• WB 检测 Stat3 的蛋白表达。发现抑制 miR-193a-3p, miR-210-3p 和 miR-5100，可以
  

回复由于缺氧释放的外泌体对 p-STAT3 表达增强的作用。


补充图 5.BMSCs 分泌的外泌体可以激活 STAT3。（动物维度-升维寻找效应变量）
小结 5.在逻辑维度上论证： 外泌体-效应变量二元论证
外泌体-效应变量调控必要性论证
外泌体-效应变量 STAT3-表型（侵袭/EMT）调控必要性论证
【逻辑维度】

细胞交互论证【有现象、找变量、分离鉴定、观察摄入、调控论证、筛分子】   
单变量论证【表达差异、一正一反、细胞、动物、临床样本】
调控性论证（细胞）
在供体细胞中阻断外泌体分泌
在受体细胞中阻断外泌体吸收（缺失）
二元变量论证

主变量调控效应变量的二元论证
主变量通过效应变量调控表型的调控必要性论证（Rescue）
间接作用机制

主变量调节表型，依赖效应变量发挥作用
另外，本文虽然整体论证比较简单，但是逻辑紧密，层层递进。  分别围绕供体细胞，和受体细胞两个维度进行论证。
既证明正常情况下，BMSCs   内出现外泌体，并且储存在胞质中，只有在【缺氧】状态下， 外泌体才会从 BMSCs 中释放，
又证明受体细胞内的外泌体是供体细胞提供的，单纯受体细胞是没有外泌体存在的。    正是由于外泌体的存在，才能促进受体细胞发现 EMT。
每个步骤抽丝剥茧，层层深入，逻辑套路值得借鉴。


【思维导图】
【数据维度】多株细胞、动物、生信、临床样本
【创新性】
miR-193a-3p 为关键词，有 127 篇
miR-210-3p 为关键词，有 122 篇
miR-5100 为关键词，有 18 篇
BMSCs, miR-193a-3p 为关键词，有 4 篇
BMSCs, miR-210-3p 为关键词，有 1 篇
BMSCs, miR-5100 为关键词，有 1 篇
BMSCs, Hypoxic 为关键词，有 205 篇
BMSCs, Hypoxic, stat3 为关键词，有 5 篇
外泌体承担创新性，创新性强；外泌体与表型的关系，创新性强；外泌体与效应变量的关系，创新性强。
【不足之处】
本文虽然有一个细胞交互的外壳，但是实际上，外泌体承担主变量，属于二元变量论证，缺乏变量交互作用的直接机制论证，包括转录因子结合位点预测，以及EMSA、luciferase  论证。后续可以考虑深入进行机制的探索。