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正義

撰写：科研矿姐 来源：小张聊科研平台的“ 课题指南针”公众号，微信公众号搜索“ 课题指南针”即可关注/扫描关注见文末
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目前针对铜代谢研究较多的疾病有铜代谢缺陷相关遗传疾病，如Wilson disease。今天就带大家一起来学习一下发表在Science advances题为“Oxysterol misbalance critically contributes to Wilson disease pathogenesis”的研究思路（PMID: 36260680）。



图片来源：PMID: 36260680

实际上，作者所在课题组在2016年发表的文章里，就阐述了一些大框架。



图片来源：PMID: 26679751

接下来，我们就来看看作者是如何传承课题组的研究哒。
疾病介绍
Wilson病（Wilson disease，WD），又称肝豆状核变性（hepatolenticular degeneration，HLD），是因铜转运ATP酶β（ATPase beta polypeptide，ATP7b）基因缺陷所致铜代谢障碍引起的常染色体隐性遗传疾病。ATP7b蛋白主要在肝脏表达。ATP7b基因的缺陷导致肝细胞通过胆汁途径排铜能力下降，以游离铜（铜蓝蛋白结合转运铜离子的能力不同程度下降或完全缺失）的形式进入血液，引起铜在肝脏及其他组织（包括脑）内蓄积，从而引起相应的临床表现和病理改变。WD的肝脏表现从无症状的肝酶升高到肝硬化或急性肝衰竭。



图片来源：PMID: 35586338；PMCID: PMC9108485

现有挑战和研究空白
临床上，目前WD的治疗包括铜螯合、锌盐和肝移植。铜螯合治疗是WD的标准疗法，对大多数患者都有好处，尤其是早期进行治疗的话。但目前所有的治疗方法有包括副作用、依从性差、成本高和可能的神经失代偿在内的局限性。因此，需要在全面了解WD发病机制的基础上进行替代和/或补充治疗。目前，铜升高引发肝纤维炎性疾病的分子机制尚不清楚。
人类WD和动物WD模型是从无症状阶段（此时肝脏铜含量高，但肝脏形态和功能未受损）发展到伴有肝脏炎症、纤维化、肝细胞损伤和显著功能损害的晚期WD。人类WD和Atp7b−/−小鼠，出生后肝脏铜含量迅速增加，然后随着疾病进展保持相当稳定。这一观察结果表明，WD的病理发展代表了一系列代谢和转录变化，这些变化放大并进一步改变了肝脏对过量铜的初始反应。相关机制尚不清楚。前期研究显示，线粒体功能障碍、表观遗传修饰和核受体信号（nuclear receptor，NR）的改变已被描述为该疾病的重要特征，但这些途径对WD炎症和纤维化的具体机制尚未阐明。
既往研究发现：NRs是调节多种细胞途径的配体依赖性转录因子。NRs是调节多种细胞途径的配体依赖性转录因子。在人类WD患者和Atp7b −/−小鼠中，发现NR [肝脏X受体（LXR）、FXR（法尼醇X受体）和PPARα]信号传导缺陷。
背景知识补充：肝脏X受体（LXR）以及类视黄醇X受体（RXR）同属于核受体超家族。LXR作为配体激活的核受体，主要以胆固醇作为配体而被激活。LXR包括LXRα（NR1H3）和LXRβ（NR1H2）2种亚型，LXRα主要在代谢活跃的组织如肝脏中高表达。
肝脏NR-LXR在WD早期被抑制。在这个症状前期阶段，LXR的抑制主要是脂质代谢调节异常，而LXR的激活可纠正这些变化并延缓年轻Atp7b−/−小鼠的肝损伤发展。LXR在以肝脏炎症和纤维化为特征的晚期WD中的作用尚不确定。NR活性与氧化应激（晚期WD的另一个众所周知的特征）之间的关系也不清楚。
本研究的实施就是为了解决以上问题。为了解决这些问题，作者研究了建立肝脏WD（Atp7b−/−）的较老小鼠模型。作者发现，细胞对Cu升高的反应涉及影响固醇产生和修饰的酶的转录变化。甾醇失衡会导致LXR抑制，从而导致炎症和纤维化。此外，作者表明，即使在临床症状出现后，LXR的药理学激活也能减少炎症和纤维化，改善肝功能。作者得出结论，甾醇失衡是Cu升高下游病理发展的重要驱动因素。
本研究所阐述的相关机制可总结简化为：



氧化甾醇失衡抑制LXR，导致WD小鼠的炎症和纤维化

小编有话说：
实际上，作者所在课题组在2016年发表的文章里，就阐述了一些大框架：例如，WD患者脂质代谢异常；使用LXR激动剂T0901317治疗并不能防止铜在肝脏中的积累；T0901317通过上调LXR靶基因子集的表达，使Atp7b−/−小鼠脂质代谢正常化；T0901317治疗可以减少Atp7b−/−肝脏的炎症和肝纤维化；LXR激动剂改善肝功能。



图片来源：PMID: 26679751

本研究是课题组之前研究的基础上，进行了细化，引入了时间观念（年老WD小鼠的炎症和肺纤维化），增加了相关阐述内容，还增加了一些创新点，如氧化应激（NRF2）、TGFβ信号通路以及硫转移酶Sult1e相关内容等，虽然相关机制的阐述仍不完整，但是推进了WD的病理机制（也是能发在IF=14.9期刊杂志的原因吧）。
那么 接下来，我们就来学习作者的具体的逻辑思路吧~
结果解读
Cu积累导致Atp7b−/−小鼠应激敏感的NRF2激活，并上调NRF2 targets
在WD中，Cu在组织中的积累降低了细胞的还原能力，导致氧化应激。为了更好地描述患有肝病的Atp7b -/-小鼠的这种反应，作者检测了氧化应激敏感转录因子NRF2的状态。肝组织切片的免疫染色显示，与年龄匹配的对照组相比，Atp7b -/- 肝脏中NRF2信号强得多，表明NRF2丰度增加（图1A）。肝脏匀浆的免疫印迹分析证实Atp7b - / -样本中NRF2蛋白水平增加（在细胞质和核组分中）（图1，B-E）。



图1 在Atp7b−/−小鼠中，应激敏感的NRF2及其targets上调

图1 在Atp7b−/−小鼠中，应激敏感的NRF2及其targets上调NRF2是个跨核质的蛋白，与抗氧化反应元件结合（ARE），调控一系列基因的表达（图1F）。RNA测序结果显示，Atp7b−/− 肝脏样品较对照组的NRF2 targets 表达显著增加（图1G），包括NRF2本身（图1F和G）。其中，最显著（倍数变化）和持续（P值）上调的转录物是硫转移酶Sult1e1（图1H），并经qPCR（见图2）和免疫染色实验证实（图1 I和J）。Sult1e1催化硫酸盐与包括24(S)-羟基胆固醇(24- OHS)在内的几种甾醇的结合。
在Atp7b−/−肝脏中，3191个mRNA与对照组相比发生了显著变化。这些转录本中只有一个子集代表NRF2的靶点，表明其他转录调控因子参与了肝脏对Cu升高的反应。利用IPA (Ingenuity Pathway Analysis)对上游调控因子进行分析，发现IFNG、TGFβ1、NR1H3 (LXRα)和TP53是导致下游mRNA变化的主要因素。在转录因子中，NR1H3 (LXRα)是最显著的调控因子；LXRα依赖变化的z总分为负(−0.8)，表明LXR活性受到部分抑制。由此可见，LXRα显著参与了肝脏对铜超载的反应。
图2A 展示（已知）：胆固醇（cholesterol）经氧化羟基化（oxidation hydroxylation）到氧化甾醇(oxysterols，OHC)，再经硫酸化（Sulfation）到氧化甾醇硫酸盐（oxysterol sulfates，OHCS）；胆固醇（cholesterol）也可直接经硫酸化（Sulfation）（Sult1e1可起此作用）生成胆固醇硫酸盐（cholesterol sulfate）；氧化甾醇(oxysterols，OHC)是LXR的内源性激活剂，而氧化甾醇硫酸盐（oxysterol sulfates，OHCS）则可抑制LXR。
综上，推测：在Atp7b - / -小鼠中，Sult1e1的显著上调表明在晚期肝病中硫酸化和非硫酸化氧化甾醇的平衡被改变，导致LXR的抑制。



与Atp7图2 在Atp7b−/−小鼠中，氧化甾醇（OHC）和氧化甾醇硫酸化（OHCS）的合成改变导致肝脏中的甾醇失衡

参与氧化甾醇合成和硫酸盐化的酶的表达改变导致了甾醇失衡b+/−肝脏相比，Atp7b−/−肝脏中细胞色素相关基因有不同程度的下调(Cyp7a1，Cyp7b1，Cyp27a1，Cyp46a1，图2B)（涉及氧化甾醇合成）。相比之下，几个硫转移酶显著上调，Sult1e1最上调，但参与胆汁酸合成的sult2a8在Atp7b−/−肝脏中显著下调(图2C)。可见参与氧化甾醇（OHC）合成和硫酸盐化的酶的丰度发生相反的变化，表明Atp7b - / -肝脏中的甾醇失衡。并通过直接测量肝组织中的OHC和OHCS得到进一步验证，OHC下调（图2E），OHCS上调（图2F）。qPCR分析还发现，最上调的Sult1e1，其mRNA水平，在Atp7b−/−肝脏中12周和20周时两个时间点均高度上调，且随年龄/疾病进展而上调(图2D)。12周和20周时胆固醇和OHCS变化的比较表明，OHCS的增加显著超过胆固醇（胆固醇是下调的）的变化，并与Sult1e1的上调有时间依赖性。因此，在已确定WD的Atp7b−/−小鼠中，内源性LXR激动剂(OHC)显著减少，同时LXR拮抗剂(OHCS)增加，与预测的LXR抑制相一致。
LXR的激活可纠正Atp7b−/−肝脏中多条紊乱的通路
为了独立验证LXR在晚期肝病中的抑制作用，作者比较了对照组杂合子(Het)、Atp7b−/−和Atp7b−/− mice treated with the synthetic LXR 激动剂 T0901317治疗的各种指标。
与对照组相比，Atp7b−/−小鼠的血清总胆固醇（T Chol）和高密度脂蛋白（HDL）较低，而T0901317药物治疗后血清总胆固醇和高密度脂蛋白升高(图3A和图S3)。肝脏甘油三酯(TG)在Atp7b -/-小鼠中也较低，使用激动剂治疗使Atp7b -/-肝脏中的TG水平接近健康对照组(未处理)(图3B)。
与对照组相比，Atp7b−/−小鼠肝脏中脂质代谢基因（LXR调控的转录本）表达下调，经药物治疗后上调了lxr依赖的脂质代谢基因(图3C)。与对照组相比，Atp7b−/−小鼠肝脏中炎症基因（LXR调控的转录本）表达上调，经药物治疗后降低了lxr依赖的炎症基因的表达(图3D)。此结果进一步表明LXR活性下降(图3C和3D)。



图3 LXR的激活可纠正Atp7b−/−肝脏中多条紊乱的通路

考虑到除了LXR之外的转录因子也被预测会出现调节失调，作者评估了LXR失活对Atp7b−/−肝脏整体病理变化的意义。主成分分析(PCA)显示对照(Het)和敲除(KO，Atp7b−/−)的转录组有明显的聚类 (图3E)。差异表达转录本的无监督聚类(图3F中的热图)证实了KO样品较对照(Het)组的显著变化。与未处理的Atp7b−/−肝脏相比，使用药物(KODrug)激活LXR会导致转录组发生显著变化，这可以从PCA图的变化中看出(图3E)。值得注意的是，LXR激动剂影响了许多转录本，KODrug和对照肝脏转录组变得更加相似(图3F)。IPA对改变通路的分析表明，用LXR激动剂治疗KO小鼠可上调脂质代谢、PPAR信号、脂肪酸、甘油三脂生物合成和胆胆酸代谢，纠正大部分下调通路(KODrug versus KO)。该药物治疗也下调了炎症信号(趋化因子、IL-2和IL-4信号)等通路，这些在未治疗的KO中被激活。该药物不影响与DNA复制和细胞周期相关的通路(图3G)。
尽管Cu过量，LXR激动剂仍能部分改善肝功能和组织学指标
为了测试LXR激活是否改善了肝功能，作者评估了几个参数。与对照组Het相比，未处理的Atp7b−/−雄性小鼠血清谷丙转氨酶(ALT)水平更高，且不受T0901317治疗的影响(图S4A)。然而，与未处理的Atp7b−/−小鼠相比，血清总胆红素有所改善(图4A)，白蛋白水平也有所改善(图4B)。



图4 尽管Cu过量，LXR激动剂仍能部分改善肝功能和组织学指标

肝脏组织和炎症细胞因子的分析(图3D)以及H&E染色结果(图4C)，炎症评分 (图4D)进一步证实了该药物的有益作用。与未治疗的KO动物相比，药物治疗导致肝脏铜水平略有下降（KO+T0）；然而，与药物治疗的对照小鼠（Het+T0）相比，KO+T0总的铜含量仍然很高(图4E)，内源性铜螯合物金属硫蛋白也保持升高。同样，在分析肝脏组织中的甾醇含量时，作者发现与未处理的Atp7b−/−肝脏相比，LXR激动剂治疗确实增加了KO+T0组的OHC水平，硫酸盐OHCS没有下降，要么升高要么不变。因此，LXR激动剂的有益作用不是由于铜水平正常化或完全恢复甾醇平衡，而是由于修正了LXR依赖通路的失调。
LXR的激活主要通过非经典TGFβ信号传导来减少Atp7b−/− 小鼠的纤维化
LXR被认为在肝纤维化中起着重要的作用，但尚未明确。因此，作者研究了LXR抑制的逆转是否会减少小鼠WD的纤维化。炎症细胞因子激活肝星形细胞(HSCs)产生胶原蛋白1α（Col 1α），导致细胞外基质沉积和肝纤维化。与对照组（Het）相比，Atp7b - / -小鼠的Col 1α mRNA约比对照组小鼠增加5倍。使用LXR激动剂后，胶原蛋白表达的增加显著减少(图5A)。类似地，金属蛋白酶1组织抑制剂(TIMP1)，炎症/纤维化肝脏疾病的另一个标志，在未治疗的Atp7b - / -小鼠肝脏中升高，在药物治疗后降低(图5A，右侧)。



图5 LXR激动剂减轻Atp7b−/−小鼠肝脏纤维化

与mRNA水平的变化一致的是，与未处理的KO相比，药物处理的KO中胶原沉积明显减少。天狼星红染色的肝区定量显示，对该药物的反应，肝纤维化减少了40%以上(P < 0.003)(图5 B和C)。这些数据，以及炎症细胞因子的减少(图3D)，表明LXR激动剂逆转/减少了HSC的激活。这一假设通过desmin(一种激活的HSC标记物)的免疫染色得到验证。Desmin在Atp7b−/−肝脏中强烈上调。药物治疗下调了Atp7b−/−小鼠的desmin，与HSC激活降低一致(图5D)。值得注意的是，尽管LXR激动剂治疗逆转了许多与肝纤维化信号相关的分子的过表达，但一些标记物仍然上调(图5E)，表明了促进纤维化的其他机制。与对照组相比，Atp7b - / -肝脏中的巨噬细胞标记物F4/80没有显著变化。
LXR激动剂通过改变非典型的TGFβ信号逆转纤维化
转录组的IPA (Ingenuity Pathway Analysis)分析发现，转化生长因子β (TGFβ)是纤维化的主要上游调节因子。TGFβ信号通路是由TGFβ与其同源受体TGFβ RII结合而启动的。TGFβ免疫组化显示，KO小鼠的实质和非实质肝细胞中均存在TGFβ信号阳性(图6A)。转录组数据提示，TGFβ RII在KO肝脏中上调，而这种上调在药物治疗后被逆转(图5E)。活化星形细胞的免疫染色(通过desmin表达确定)证实KO的TGFβ RII(红色)表达明显高于对照组Het，药物治疗降低了TGFβRII信号(图6B)，这与转录组数据一致。
为了更好地理解TGFβ RII丰度的变化是如何与其功能的变化相结合，作者评估了其下游信号分子的状态。
TGFβ信号是通过典型SMAD和非典型MAPK信号通路介导的(图6C)。在KO和药物治疗的KO肝脏中，SMAD2蛋白水平同样增加，这表明药物不影响经典SMAD通路的组成部分(图6D)。相比之下，非典型的TGFβ (MAPKs)信号通路受药物影响，如ERK1/2，p38，JNK的表达，这些变化在KO肝脏T0901317处理后被逆转(图6, D和E)。转录本的变化与蛋白质数据一致。KO小鼠肝脏中MAPK [MAPK激酶1 (MEK1)，ERK1, p38, JNK1和JNK2]和SMAD (SMAD2-SMAD4) mRNA表达量增加超过1.5倍(P < 0.05)(图6, F和G)。药物治疗降低了KO小鼠的MAPK转录水平(图6F)，但不影响SMAD2, SMAD3和SMAD4水平(图6G)。



图6 LXR激动剂主要通过非典型TGFβ信号降低Atp7b−/−小鼠的纤维化

Rho-like鸟苷三磷酸酶(GTPases)是调节TGF β介导的细胞骨架运动的蛋白质家族，其作用独立于经典SMAD信号。Atp7b−/−小鼠Rho GTPase mRNA显著升高。药物治疗降低了KO小鼠的这些转录本水平。为了进一步验证Rho GTPase信号的变化，作者检查了下游信号激酶级联。Rho相关激酶在KO小鼠肝脏中的表达明显高于Het小鼠，药物治疗降低了KO小鼠中的Rho相关激酶的表达（较与未治疗KO小鼠相比）。所有这些数据表明，Atp7b−/−小鼠肝脏20周时炎症和纤维化的药物依赖性减少与非典型的TGF β信号通路有关。
抑制硫转移酶Sult1e逆转固醇失衡并激活LXR
最后，作者测试了OHC和OHCS水平的正常化是否会逆转LXR抑制引起的转录变化。转移酶抑制剂Sult1e1=triclosan。如上所述，与对照组相比，未经处理的Atp7b−/− 小鼠中的OHC含量降低。与未治疗的KO小鼠相比，用Sult1e1抑制剂治疗显著增加了KO小鼠肝脏中24-OHC和25-OHC的水平，还检测到27-OHC的增加不太显著（图7B），同时硫酸化24-OHCS、25-OHCS和DHEAS水平显著降低（图7C）。



图7 抑制磺基转移酶Sult1e逆转固醇失衡，激活LXR

LXR激动剂（OHC）的增加和LXR拮抗剂（OHCS）的减少有望减轻LXR抑制并增加脂肪生成，同时抑制炎症反应。与用LXR激动剂治疗类似，在Atp7b−/− 小鼠肝脏中抑制Sult1e增加了脂肪生成酶（FASN和SCD1）的mRNA水平，并降低了炎症标志物（iNOS、IL-6、IL-1β、COX2和TNFα）的表达（图7D）。这些数据强烈表明，氧化甾醇平衡的恢复逆转了WD小鼠LXR抑制的作用。为了了解Sult1e1的抑制药物是否可能改善纤维化，作者检测了纤维化基因的表达。Atp7b−/−中Col1α和Timp1表达的增加，在经triclosan处理后，表达显著减少。作者还检测了调节胆汁酸和脂质代谢的NR FXR/RXR，其在Atp7b−/− 小鼠中的表达减少。然而，用triclosan治疗并不能恢复FXR/RXR靶基因（SHP和BSEP）的表达。
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